Zentrum für Biochemie und Molekularbiologie

Forschung

Extrazelluläre Thiol-Switches sind kaum charakterisiert und resultieren in posttranslationale Modifikationen, welche eine Änderung in der Struktur der Zielproteine induzieren und damit in ihrer Aktivität. Dieses schnelle Schalten kann sowohl aktivierend als auch inaktivierend sein. Induziert werden diese Thiol-Switches durch die katalytische Aktivität von Oxidoreduktasen wie PDIs (Protein Disulfid Isomerasen), welche nicht nur im ER, sondern auch auf der Zelloberfläche von eukaryotischen Zellen zu finden sind. Wir fokussieren uns auf den inaktivierenden Thiol-Switch innerhalb des extrazellulären Bereichs der transmembranen Protease ADAM17 (“A Disintegrin and Metalloprotease 17”). Die strukturelle Änderung innerhalb der Zieldomäne ist auf molekulare Ebene geklärt und basiert auf der Isomerisierung zweier Disulfidbrücken. Dies überführt eine flexible Domäne in eine starre Struktur wodurch die Substraterkennung und Aktivität der Protease aufgehoben wird. Unbekannt sind seine Regulation und die „Rahmenbedingungen“ unter denen er stattfindet. Zur Charakterisierung dieser Fragen verwenden wir state of the art proteinbiochemische-, molekularbiologische- und zellbiologische Methoden.

Motivation: Warum der Thiol Switch in ADAM17?

Freisetzung von Mediatoren durch Ectodomänen Shedding.

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Abbildung 1: Ausschnitt aus der Regulierung von ADAM17.

Posttranslationale Modifikationen erlauben dem Organismus sich schnell an sich ändernden Situationen, wie eine bakterielle Infektion, anzupassen. Dabei werden konservierte Motive der Pathogene erkannt und das Immunsystem aktiviert. Hierbei kommt es durch limitierte Proteolyse an der Zelloberfläche zu einer schellen Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren wie TNFα (Tumor Nekrose Faktor α) und den löslichen IL-6R (Interleukin-6 Rezeptor; Abb. 1-5). Dieser als „Ektodomänen Shedding„ bezeichneter Prozess erfolgt durch transmembrane Proteasen wie ADAM17 („A Disintegrin and Metalloprotease 17”). ADAM17 ist für die Freisetzung einer Vielzahl an Proteinen verantwortlich. Dazu gehören neben TNFα und dem löslichen IL-6R auch Adhäsionsmoleküle, Chemokine und Wachstumsfaktoren der EGFR-L (Epidermal Growth Factor Rezeptor Liganden, Abb. 1-13) [1-5]. Entsprechend seinem Repertoire an Substraten beeinflusst die shedding Aktivität von ADAM17 nicht nur die Initiation und Progression einer Immunantwort sondern auch Zellmobilität und Proliferation. Eine unkontrollierte Freisetzung der Substrate von ADAM17 ist dementsprechend mit Autoimmunerkrankungen, chronischen Entzündungen und Tumor Entstehung und Progression verbunden. Daher ist die Aktivität von ADAM17 streng kontrolliert. ADAM17 wird als Zymogen (Abb. 1-1) in das ER hinein transloziert. Im Golgi Apparat wird die inhibitorische Prodomäne abgespalten, wodurch das reife Enzym entsteht (Abb. 1-2) [6, 7]. Ein großer Anteil der Protease wird intrazellulär gelagert und kann durch Stimulation mit PMA an die Zelloberfläche gebracht werden [8, 9]. ADAM17 befindet sich innerhalb der Lipidrafts und ist im Ruhe Zustand nahezu inaktiv (Abb. 1-3) [10]. Die shedding Aktivität der Protease kann durch eine Vielzahl von Stimuli, wie LPS, Thrombin, Histamin, ATP und Wachstumsfaktoren aktiviert werden [11-13].

Die Funktionen der extrazellulären Domänen.

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Abbildung 2: Modell der Aktivierung von ADAM17 durch den Flip von Phosphatidylserin (orange Sterne).

Das Fehlen des zytoplasmatischen Bereichs von ADAM17 wirkt sich nicht signifikant auf seine Aktivität aus [14-16]. Dies deutet daraufhin, dass der extrazelluläre Bereich von ADAM17 eine entscheidende Funktion in der Aktivierung und Inaktivierung der Protease hat. Im extrazellulär besteht die reife Form, beginnend vom N-Terminus, aus der katalytisch aktiven Metalloproteasen Domäne, einer Disintegrin- und einer membran-proximalen Domäne (MPD). An der MPD schließt sich direkt ein hoch konservierter α-helikaler Bereich an, der als CANDIS („Conserved ADAM seventeen dynamic interaction sequence") bezeichnet wird und mit der MPD nicht nur für die Substraterkennung verantwortlich ist, sondern einen Schalter der shedding Aktivität der Protease bildet [17-19]. Dabei wird der Disintegrin Domäne eine scaffold Funktion zugeschrieben in der sie die MPD in die Nähe der katalytischen Domäne bringt, wodurch eine C-ähnliche Form des extrazellulären Bereiches entstehen soll [20, 21]. Sowohl die MPD als auch CANDIS interagieren mit der Plasmamembran [18, 22]. Hierbei wird die Bindung der MPD durch Phosphatidylserin induziert. Phosphatidylserin, befindet sich im Ruhezustand einer Zelle in der Innenseite der Plasmamembran (Abb. 1-3; 2A) und wird durch eine Reihe von Stimuli von ADAM17 zur Außenseite der Plasmamembran gedreht (Abb. 1-4; 2B) [22]. In unserem Modell orientiert die Membranbindung der MPD den extrazellulären Bereich so, dass sich die räumlich nahe katalytische Domäne dicht an der Membran befindet und dadurch ihre Substrate kurz oberhalb der Membran schneiden kann, wo sich die Schnittstellen der Protease befinden [23].

Inaktivierung durch einen Thiol-Switch.

Extrazelluläre PDIs können ADAM17 durch einen Thiol-Switch innerhalb der MPD inaktiveren (Abb. 1-6) [24, 25]. Dies führt dazu, dass die flexible Form von ADAM17 in eine starre überführt wird, welche nicht mehr in der Lage ist, Substrate zu binden bzw. mit Phosphatidylserin zu interagieren [22, 25]. Dementsprechend ist die Protease inaktiv. Interessanterweise, wird ADAM17, welches in den Lipidrafts aktiv ist, hauptsächlich über Clathrin-abhängige Endozytose aus den nicht-Lipidrafts Regionen heraus internalisiert (Abb. 1-7) und bei PMA Stimulation im Lysosomen degradiert (Abb. 1-8/9) [9]. Die Protease wird nach seiner Endozytose nicht nur degradiert, sondern auch recycelt (Abb. 1-10) [26].

Inhibitorische Interaktionspartner.

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Abbildung 1: Ausschnitt aus der Regulierung von ADAM17.

Im Ruhezustand wird durch inhibitorische Wechselwirkungen der inaktive Zustand der Protease sichergestellt. So bindet ADAM17 über seine Disintegrin-Domäne an β1-Integrin [27]. Dies erlaubt zum einen eine Adhäsion an Zellen „in trans“ und verhindert zum anderen, dass Substrate gebunden und gespalten werden [27, 28]. Kommt es zu einer Aktivierung unterlaufen beide Proteine einer Strukturänderung, wodurch ihre Interaktion aufgehoben und die Substratspaltung durch ADAM17 und Liganden Bindung durch Integrinen möglich wird [29, 30]. Auch die Interaktion von ADAM17 mit TIMP3 im Ruhezustand verhindert die Spaltung von Substraten [31, 32]. Hier bei bildet ADAM17 Multimere/ Dimer, woran ebenfalls die Schalteinheit MPD-CANDIS beteiligt ist [33]. Kommt es zu einer Aktivierung, monomerisiert ADAM17 und die Interaktion mit TIMP3 wird aufgehoben [32].

Die detaillierten molekularen Folgen des Thiol-Switches.

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Abbildung 3: der Thiol-Switch in ADAM17

Durch Strukturaufklärung mittels NMR und Massenspektrometrie konnte auf molekularer Ebene beschrieben werden, was im Detail bei dem Thiol-Switch in ADAM17 geschieht [25]. Hierbei katalysiert die reduziert vorliegende PDI die Isomerisierung von zwei Disulfidbrücken innerhalb der MPD, welche als isolierte Domäne in E. coli exprimiert werden konnte (Abb. 3). Die löslich exprimierte Domäne liegt in der offenen und flexiblen Form vor, welche die lineare Anordnung von den zwei Disulfidbrücken C600-C630 und C635-C640 enthält (Abb. 3A und 3B). Diese offene Form erlaubt sowohl die Substraterkennung als auch die Membraninteraktion und wird durch die PDI in die geschlossene und starre Form der MPD mit dem überlappenden Disulfidbrückenmuster C600-C635 und C630-C640 überführt (Abb. 3C und D). Dadurch wird der flexible in Abb. 3A rot dargestellte Bereich, welcher in den korrespondierenden NMR Spektren nicht sichtbar ist, dicht an den gründargestellten konservierten Bereich gebracht wie in der mittels NMR gelösten Struktur in Abb. 3C dargestellt. Dies verhindert die Substraterkennung, Membraninteraktion und damit die shedding Aktivität der Protease [22, 25].

 

Auch wenn die Konsequenzen des Thiol-Switches innerhalb von ADAM17 bekannt sind, sind wir sehr an der weiteren Aufklärung des Thiol-Switch als schnellen posttranslationalen Schalter in extrazellulären Proteinen interessiert. Eine von vielen spannenden und offenen Fragen ist, ob Thiol-Switches reversibel sind.
Die Arbeiten erfolgen innerhalb des von der Deutschen Forschungsgemeinschaft geförderten SPP1710 „Dynamics of Thiol-based Redox Switches in Cellular PhysiologySPP1710 ,eingegliedert in der Arbeitsgruppe „Strukturbiologie" von Herrn Professor Axel J. Scheidig“ und in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Joachim Grötzinger im Biochemisches Institut, Kiel.

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